Cytométrie en flux/Le réglage et la compensation
Comme pour toutes machines, un cytomètre doit se régler. Techniquement, nous ne parlerons ici que des réglages nécessaires à l'acquisition des données, pas au réglage des optiques et des lasers.
Il y a deux types de réglages :
- les réglages « machine », c'est-à-dire l'amplification du signal capté par les PMT (photomultiplier tube), et la compensation ;
- les réglages d'analyse, qui permettent d'interpréter les résultats.
Réglage des PMT
[modifier | modifier le wikicode]Pour régler le gain des PMT, il "suffit" de faire passer une suspension de cellules marquées avec l'isotype correspondant au marquage que l’on souhaite observer ensuite. On définit grâce à ce marquage isotypique la limite entre les évènements "positifs" et "négatifs" selon qu’ils dépassent ou non ce seuil. Pour que cette limite soit facile à mettre, il faut obtenir de la suspension qu'elle produise un signal ni trop fort, pour laisser de la marge aux évènements positifs d'apparaître ensuite, ni trop faible, pour pouvoir observer l’ensemble du nuage négatif.
Matrice de compensation
[modifier | modifier le wikicode]Les compensations résultent de deux insuffisances. D'une part, les fluorochromes utilisés n'ont pas une raie d'émission fine, mais un spectre large ; d’autre part les trajets optiques des rayons lumineux ne permettent de sélectionner que des plages de longueurs d'onde. Il en résulte que certains fluorochromes vont émettre de la lumière dans des longueurs d'ondes captées par un PMT qui ne leur est pas destiné. Pour certains fluorochromes au spectre d'émission très large, ce phénomène peut polluer de nombreux PMT. Le problème posé est donc subtil : un signal fort dans un PMT1 peut provoquer un signal dans un PMT2 sans qu'aucun évènement ne soit positif pour la couleur destinée au PMT2.
La solution informatique est simple en théorie: pour corriger l'intensité lumineuse émise par un fluorochrome, perçue en trop par un PMT, on soustrait à ce signal une proportion du signal produit par le PMT destiné à ce fluorochrome. En pratique, on obtient une matrice de compensation, puisque le signal de chaque PMT doit être compensé pour les signaux de chacun des autres.
Exemple
[modifier | modifier le wikicode]| Avant compensation | Après compensation | ||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
signal2=signal2-0%xsignal1 |
signal2=signal2-30%xsignal1 |
Dans cet exemple, le fluorochrome utilisé en PMT1 produit un signal parasite en PMT2. En utilisant les valeurs produites par des cellules négatives pour les deux canaux, on peut calculer simplement la proportion du signal 1 à ôter du signal 2 pour retrouver une valeur correcte.
dans l'exemple, les 30% sont obtenus par les valeurs avant compensation en calculant la proportion de signal 2 sans bruit par rapport au signal 1 sans bruit:
Problèmes
[modifier | modifier le wikicode]On ne se représente pas immédiatement les problèmes liés à une mauvaise compensation. Si un signal est trop compensé, les résultats seront aussi faux que s'il ne l'est pas assez. Il faut donc prendre un soin particulier à cette opération qui conditionne l'exploitation des données produites.
La compensation représente une opération de plus en plus délicate à mesure que le nombre de PMT utilisés augmente. La matrice de compensation augmente d'autant plus.
Réglage des isotypes
[modifier | modifier le wikicode]Les isotypes, ou marquage isotypiques sont en fait une manière commode de parler de la fluorescence spontanée des cellules traitées avec un anticorps fluorescent mais ne le fixant pas.
Le problème vient de ce que les anticorps étant des protéines, ils possèdent des propriétés d'adhésion variées, et vont plus ou moins s'adsorber (coller aux cellules). Il y a deux paramètres qui font varier cette adsorption : le type de cellule analysée et le type d'anticorps utilisé.
- Selon la cellule, la surface sera plus ou moins plissée, plus ou moins riche en protéines d'adhésion, etc., ce qui pourra faire changer l'adsorption des protéines à sa surface.
- Selon les isotypes utilisés et l'espèce animale qui a produit l'anticorps, les anticorps vont s'adsorber plus ou moins facilement sur les cellules.
La combinaison de ces deux facteurs peut donner des intensités de marquage négatif très diverses. C’est pourquoi il est important de situer correctement le niveau de fluorescence des cellules traitées avec un anticorps mais non marquées par lui.
Pour ce faire, on utilise un anticorps monoclonal purifié, produit chez la même espèce et du même isotype que l'anticorps d'intérêt, et on "marque" les cellules avec. L'intensité du marquage obtenue permet de déterminer le niveau de fluorescence des cellules "négatives" pour ce marqueur.
